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為什么銀染實(shí)驗要用EDI水?

文章出處:網(wǎng)絡(luò ) 人氣:發(fā)表時(shí)間:2023-02-10

SDS聚丙烯酰胺凝膠染色是蛋白質(zhì)研究的一個(gè)基礎方法。染色方法有很多,實(shí)際應用中,考馬斯亮藍染色(考染)和銀染是運用的最多的方法。考馬斯亮藍G250在游離狀態(tài)下呈紅色,它與蛋白質(zhì)結合后變?yōu)樗{色,結合物在595 nm波長(cháng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。

銀染實(shí)驗中,在堿性條件下,銀離子被還原成金屬銀,沉淀在蛋白質(zhì)的表面上顯色。蛋白電泳后的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠在甲醇溶液中浸泡后,水洗后用硝酸銀溶液銀染,再水洗后用碳酸鈉甲醇水溶液顯色。

與考染相比,銀染具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),很多做環(huán)境、植物、育種等方面的客戶(hù),都會(huì )做銀染方面的實(shí)驗。銀染對于試劑的要求比較高,尤其對其中使用純水的水質(zhì)要求比較高。

一、儀器和試劑

乙酸(1%),顯影液(2.5%碳酸鈉和0.02%甲醛水溶液),乙醇(30%),固定液(乙醇:冰醋酸:水(30:10:60)),硝酸銀溶液(0.1%),顯影液(將溶液A在850 mL去離子水中加入37 g NaCl和37 g CuSO4,再加入濃氨水直到深藍色沉淀形成然后溶解,定容至1 L)和溶液B(在900 mL去離子水中加入436 g 硫代硫酸鈉,定容至1 L)混合,加三倍水稀釋?zhuān)⒓词褂?/p>

二、試驗方法

1. 通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì);

2. 將凝膠浸泡在至少5倍體積的固定液中,室溫下平緩搖動(dòng)4 - 12 h,使蛋白固定;

3. 棄去固定液,加至少5倍體積的30%乙醇,室溫下平緩搖動(dòng)30 min;

4. 重復步驟3;

5. 棄去乙醇,加10倍體積的純水(去離子水),室溫下平緩搖動(dòng)10 min;

6. 重復步驟5兩次;

7. 棄去清洗用水,加5倍體積的硝酸銀溶液,室溫下平緩搖動(dòng)30 min;

8. 棄去硝酸銀溶液,用純水(去離子水)漂洗凝膠兩面,每面20 s;

9. 加5倍體積的新鮮顯影液,室溫下平緩搖動(dòng),數分鐘內出現蛋白質(zhì)的染色條帶,繼續至條帶清晰;

10. 用1%乙酸清洗凝膠終止反應,再用純水(去離子水)水漂洗數次,每次10 min。

銀染后的凝膠可以通過(guò)凝膠成像系統或掃描儀轉化為照片,或者可以直接用手機拍攝。

在銀染實(shí)驗中,純水(去離子水)水質(zhì)非常重要,對實(shí)驗成功與否起著(zhù)關(guān)鍵性的作用。有用戶(hù)在實(shí)驗中忽略了這一點(diǎn),純水水質(zhì)不佳,導致氯離子含量超標,浸泡時(shí)出現硝酸銀沉淀,沉淀在膠上,最后顯影的時(shí)候看到的是一片花花的亂象,影響了染色效果。

氯化銀的溶解度通常是2 ppm,氯離子是水中常見(jiàn)的一種離子雜質(zhì),如果水中的氯離子超過(guò)2 ppm,即有可能出現雜質(zhì),也就是說(shuō),對于銀染實(shí)驗,對于純水質(zhì)量的要求還是比較苛刻的,一般的反滲透純水(RO)設備,還難以達到要求。

另外,水中的顆粒物也會(huì )吸附銀離子沉淀顯色,污染背景,甚至讓好好的凝膠成了“大花臉”。因此制備出來(lái)的純水在使用前,還應該通過(guò)0.22或0.45μm的過(guò)濾器預先過(guò)濾,以去除水中的顆粒物。

專(zhuān)業(yè)來(lái)講,銀染用水應該盡量選用符合國標《分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法》(GB/T 6682-2008二級純水以上的水—電導率至少應當在 1 μS/cm以下。

因此,銀染用水應當使用EDI純水或者超純水,而RO 純水是不能滿(mǎn)足銀染用水需求。

國內做實(shí)驗室EDI純水設備的廠(chǎng)家很少。滲源是國內最早生產(chǎn)EDI實(shí)驗室純水設備的供應商。滲源新一代SYH智能型一體化超純水系統可以同時(shí)制備EDI 純水和超純水。SYH生產(chǎn)的 EDI 純水水質(zhì)完全滿(mǎn)足銀染實(shí)驗,還可以用來(lái)配制其他相關(guān)實(shí)驗的試劑;超純水可以應用于銀染實(shí)驗的上下游以及其他蛋白質(zhì)研究實(shí)驗,例如蛋白SDS-PAGE電泳、Western Blotting等。取水終端安裝的終端微濾器,可以制備無(wú)熱原(內毒素)、核酸酶、細菌的超純水,用于生化分析和分子生物學(xué)。

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